Электромагнитные поля и наномагнитные частицы увеличивают остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека

1. Вступление Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой широко используемые...
2. Остеогенная дифференциация hBM-MSCs
3. Воздействие ЭМП
4. Подготовка и характеризация Fe3O4 MPs
5. Иммуногистохимическое окрашивание
6. окрашивание фон Косса
7. РТ-КПЦР
8. Таблица I
9. Таблица I
10. Вестерн-блот анализ
11. Анализ антигена клеточной поверхности методом флуоресцентной сортировки клеток (FACS)
12. Анализ пролиферации и активности hBM-MSCs
13. Анализ ЛДГ
14. Анализ ALP
15. Результаты и обсуждение
16. Иммуногистохимическое окрашивание
17. Таблица II
18. Таблица II
19. РТ-КПЦР
20. Вестерн-блот анализ
21. Анализ FACS
22. Анализ клеточной пролиферации и активности
23. Активность ЛДГ и АЛП
24. Подтверждения
25. Рекомендации

Вступление

Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой широко используемые взрослые стволовые клетки, которые обладают потенциалом самообновления и способностью к мультипотентной дифференцировке клеток. В частности, мезенхимальные стволовые клетки человеческого костного мозга (hBM-MSCs) были экспериментально использованы в ряде клеточных терапий и в регенеративной медицине из-за их обильных и неонкогенных свойств ( 1 ). hBM-MSC обладают способностью дифференцироваться в различные типы клеток, такие как фибробласты, хондроциты, адипоциты и остеобласты ( 2 ). Кроме того, hBM-MSCs играют важную роль в восстановлении кости ( 3 ).

Предыдущие исследования показали, что регенерация кости происходит после электростимуляции и приводит к развитию кости ( 4 , 5 ). На основании этих знаний было исследовано влияние электромагнитных полей (ЭМП) на остеогенез. Недавно было сообщено, что чрезвычайно низкая частота стимуляции ЭМП играет существенную роль в остеогенной дифференцировке и пролиферации hBM-MSCs. Цай и др. ( 6 ) продемонстрировали, что воздействие крайне низкой частоты ЭМП (7,5 Гц) играет модулирующую роль в остеогенной дифференцировке hBM-MSCs с увеличением уровней щелочной фосфатазы (ALP). Sun et al ( 7 ) продемонстрировали, что частота 15 Гц ЭДС увеличивала экспрессию генов, связанных с остеогенезом, в hBM-MSC.

Наномагнитные частицы (МП) широко используются в биомедицине. Депутаты могут применяться для доставки лекарств, биологических меток и обнаружения белков благодаря их контролируемому размеру и магнитным свойствам ( 8 ). Картмелл и др. ( 9 ) сообщили, что механическая стимуляция первичных остеобластов человека с помощью технологии магнитных частиц влияла на остеобластическую активность. В настоящем исследовании MP оксида железа (Fe 3 O 4) были инкапсулированы в оболочку из полиэтиленгликоля (PEG) -фосфолипида для улучшенной биосовместимости.

В настоящем исследовании мы исследовали влияние воздействия ЭМП и лечения Fe 3 O 4 MP на остеогенную дифференциацию hBM-MSCs. hBM-MSC обрабатывали 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP или подвергали воздействию частоты 45 Гц с интенсивностью 1 мТл ЭДС дважды каждые 8 ​​часов в день в течение 7 дней. Мы также исследовали, является ли лечение Fe 3 O 4 MP в сочетании с воздействием ЭМП более эффективным для усиления остеогенной дифференцировки. Остеогенную дифференциацию анализировали иммуногистохимическим окрашиванием, вестерн-блоттингом, количественной обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) и измерением активности ALP. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в 4 экспериментальных группах была сходной; это говорит о том, что лечение не влияло на секрецию ЛДГ и не вызывало повреждения клеточной мембраны.

материалы и методы

Культура клеток

hBM-MSC были приобретены в Lonza (Базель, Швейцария) и содержались в культуре в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Welgene, Тэджон, Корея) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Lonza), 1% пенициллина / стрептомицина (PS ; Welgene), 25 мкМ 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в инкубаторе с температурой 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2. HBM-MSC использовали из пассажей 4-7 с аналогичными результатами, полученными повсюду.

Остеогенная дифференциация hBM-MSCs

Остеогенная дифференцирующая среда состояла из DMEM (Welgene) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Lonza), 1% пенициллина / стрептомицина (PS; Welgene), 10 мМ β-глицерофосфата (Sigma-Aldrich), 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma-Aldrich) и 100 нМ дексаметазон (Sigma-Aldrich). Среду меняли каждые 2–3 дня.

Воздействие ЭМП

Схематическое изображение синусоидального устройства ЭДС представлено в рисунок 1 , Устройство ЭДС было помещено в инкубатор при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2.

Блок стимуляции предназначен для работы с парой одинаковых катушек диаметром 30 см, собранных в конфигурации Гельмгольца. Пара катушек работает на переменном токе, генерируя ЭДС. Ток в катушке контролируется генератором. Приложенное магнитное поле состояло из частоты 45 Гц и интенсивности 1 мТл два раза каждые 8 ​​часов в день в течение 7 дней. Клетки высевали в чашку для культивирования или чашку.

Подготовка и характеризация Fe3O4 MPs

Вододиспергируемые и биосовместимые Fe 3 O 4 MP были приготовлены с использованием метода, описанного ранее с некоторыми модификациями ( 10 ). Монодисперсные Fe 3 O 4 MP были диспергированы в неполярном органическом растворителе и синтезированы с использованием высокотемпературной реакции в фазе органического раствора. Железо (III) ацетилацетонат (Fe (acac) 3, 2 ммоль; 99,9%), 1,2-гексадекандиол (10 ммоль; 90%), олеиновая кислота (6 ммоль; 99%), олеиламин (6 ммоль; 70%) и 1-октадецен (20 мл; 90%) (все от Sigma-Aldrich) смешивали и магнитно перемешивали в атмосфере азота. Смесь нагревали до 200 ° C в течение 2 часов и затем нагревали до температуры кипения с обратным холодильником (~ 300 ° C) в течение дополнительного часа. Смесь черного цвета охлаждали до комнатной температуры. Этанол (40 мл) добавляли к смеси в условиях окружающей среды, и черный материал осаждали и отделяли центрифугированием (12000 об / мин, 30 мин). Черный продукт повторно диспергировали в гексане в присутствии олеиновой кислоты (~ 0,05 мл) и олеиламина (~ 0,05 мл). Центрифугирование (6000 об / мин, 10 мин) применяли для удаления любого недиспергированного остатка. Затем продукт осаждали этанолом, центрифугировали (10000 об / мин, 20 мин) для удаления растворителя и повторно диспергировали в органических растворителях, таких как н-гексан и хлороформ. Полученные Fe 3 O 4 MP, диспергированные в хлороформе, инкапсулировали в PEG-фосфолипидную оболочку, чтобы сделать их биосовместимыми. Обычно 2 мл органического диспергируемого Fe 3 O 4 MP размером 12 нм в хлороформе (5 мг / мл) смешивали с 1 мл раствора хлороформа, содержащего 10 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (PEG) -2000] (mPEG-2000 PE) (Avanti Polar Lipids, Inc.) в соотношении 5: 1. После полного выпаривания хлороформа остаток инкубировали при 80 ° C в вакууме в течение 1 часа. Добавляли пять миллилитров воды, что давало прозрачную темно-коричневую суспензию, содержащую мицеллы ПЭГ-РЕ. Поскольку эта суспензия содержала как пустые мицеллы, так и мицеллы, содержащие МП, пустые мицеллы удаляли ультрацентрифугированием. Мицеллы, содержащие МП, образовывали осадок, тогда как пустые мицеллы оставались суспендированными. Супернатант отбрасывали, а мицеллы МР ресуспендировали в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS). В настоящем исследовании 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP были добавлены в среду для остеогенной дифференцировки.

Иммуногистохимическое окрашивание

Клетки, культивируемые на покровном стекле, фиксировали в течение 20 мин при 4 ° С, используя 10% формалин с нейтральным буфером, и затем 3 раза промывали PBS (рН 7,2). Эти покровные стекла затем инкубировали с антиостеокальцином (предварительное разведение, AM 386; BioGenex, Сан-Рамон, Калифорния, США), антиостеопонтином (разведение 1: 1000) и антиостеонектином (разведение 1: 500; AB 1858, Chemicon, Карлсбад, Калифорния, США) антитела в течение 24 часов с последующей разработкой с использованием реагента EnVision Plus (Dako, Carpinteria, CA, USA), диаминобензидина в качестве хромогена и гематоксилина Майера в качестве контрстейна.

окрашивание фон Косса

Минерализованный матрикс клеток оценивали, используя 5% нитрат серебра (Sigma-Aldrich) в ультрафиолетовом свете в течение 60 минут, с последующим добавлением 3% тиосульфата натрия (Sigma-Aldrich) в течение 5 минут и затем окрашивая Ван Гизоном (Сигма-Олдрич) в течение 5 мин. При таком способе окрашивания минеральная матрица окрашивается в черный цвет, а остеоид (неминерализованная матрица) окрашивается в красный цвет.

РТ-КПЦР

Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием 500 мкл реагента TRIzol (Sigma-Aldrich). Затем добавляли 100 мкл хлороформа и раствор перемешивали и инкубировали в течение 3 минут. После центрифугирования (12000 об / мин, 4 ° С в течение 15 мин) верхнюю фазу переносили в новую пробирку и добавляли 500 мкл изопропанола. После 10-минутного инкубационного периода и еще одной стадии центрифугирования (14000 об / мин, 4 ° С в течение 10 минут) супернатант отбрасывали. Осадок промывали 1 мл 70% этанола и центрифугировали (9500 об / мин, 4 ° С в течение 5 минут). Супернатант отбрасывали, а осадок сушили. После добавления 20 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), осадок растворяли в течение 10 минут на льду. Количество и чистоту суммарной РНК определяли с использованием нанодроп-спектрофотометра (Национальный университет Хэнкионг). Реакции обратной транскриптазы (RT) использовали для синтеза кДНК из 1 мкг общей РНК с использованием набора Advantage RT-for-RCR (Clontech Laboratories, Inc., Пало-Альто, Калифорния, США). ОТ-ПЦР проводилась регулярно. Образец охлаждали до -20 ° С и хранили до дальнейшего анализа. Для ПЦР праймеры были приобретены у Bioneer Corp. (Deajeon, Корея). Последовательности праймеров, используемые для количественной ПЦР, перечислены в Таблица I ,

Таблица I

Праймеры использовали для RT-КПЦР.

Таблица I

Праймеры использовали для RT-КПЦР.

Гены Последовательность праймера вверх по течению Последовательность праймера вниз по течению GAPDH 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACC 3 '5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3 ′ Коллаген I 5′-GAA AAC ATC CCA GCC AAG AA-3 ′ 5 ′ -CAG GTT GCC AGT CTC CTC AT-3 ′ Коллаген III 5′-CAG GTG AAC GTG GAG CTG C-3 ′ 5′-TGC CAC ACG TGT TTC CGT GG-3 ′ Остеонектин 5′-CCA GAA CCA CCA CTG CAA CAA AC-3 ′ 5′-GGC AGG AAG AGT CGA AGG TC-3 ′ Остеокальцин 5′-AGG GGA AGA GGA AAG AAG GG-3 ′ 5′-CCA GGC GCT ACC TGT ATC AA-3 ′ Остеопонтин 5′-TCG CAG ACC TGA CAT CCA GT-3 ′ 5′-TCG GAA TGC TCA TTG CTC TC-3 ′ BMP-2 5′-GTC CAG CTG TAA GAG ACA CC-3 ′ 5′-GTA CTA GCG ACA CCC ACA AC-3 ′ Runx-2 5'-CTC ACT ACC ACA CCT ACC TG-3 ′ 5′-TCA ATA TGG TCG CCA AAC AGA TTC-3 ′ BSP 5′-CAC AGC CTC ATC TTC ATG G-3 ′ 5′-GCA TCT CAT AGT GCA TCT GG-3 ′ CACNA1C 5′-ACA GTG ACC AGT GTG GTG GA-3 ′ 5′-CGT AGC CTC TGG AGA ACC TG-3 ′ CACNA1E 5′-GTT CGG CCG CGA TCA CCT TTG T-3 ′ 5 ′ -GGC GGC CAA TCG ATG AGC TTC T-3 ′ CACNA1G 5′-CGG CAA CTAC GTG CTC TTC A-3 ′ 5′-GTG ACT TCA TCT CGT GGG CC-3 ′ CACNA1I 5′-CGT TGT CAT AGC GAC CCA GTT-3 ′ 5′-CAC AGC TCT CTT CCC CGA GTG A-3 ′

Вестерн-блот анализ

Через 10 дней культивирования клеток клетки лизировали буфером RIPA, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS (Sigma-Aldrich), ингибиторы протеазы. (Complete ™; Roche Diagnostics, Мангейм, Германия). Белок (30 мкг) затем разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и промокали на нитроцеллюлозные мембраны, которые затем блокировали 5% обезжиренным молоком в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,2% Твин-20. Вестерн-блот-анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя (Abcam, Cambridge, MA, USA) со следующими первичными антителами: анти-костный сиалопротеин (BSP, ab52128; Abcam), анти-костный морфогенетический белок 2 (BMP-2, ab17885; Abcam), анти-остеопонтин (ab63856; Abcam), анти-остеонектин (ab14174; Abcam), антифосфорилированная внеклеточная регулирующая сигнал киназа (p-ERK, # 9101; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) и анти- актин (ab3280; Abcam). Блоты инкубировали с первичными антителами в разведении 1: 5000, а затем инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (# 7076; Cell Signaling Technology).

Анализ антигена клеточной поверхности методом флуоресцентной сортировки клеток (FACS)

Антитела против человеческих антигенов, CD73 и CD90, были приобретены у BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния, США), а антитело против CD105 было приобретено у Ancell Corp. (Бейпорт, Миннесота, США). В общей сложности 5 × 10 5 клеток ресуспендируют в 200 мкл PBS и инкубируют с антителами, конъюгированными с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) или фикоэритрином (PE), в течение 20 минут при комнатной температуре (или в течение 45 минут при 4 ° C). Интенсивность флуоресценции клеток оценивали с использованием проточного цитометра (FACScan; BD Biosciences), а данные анализировали с использованием программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).

Анализ пролиферации и активности hBM-MSCs

Пролиферацию и активность клеток измеряли с использованием счетчика клеток (Scepter ™; Millipore Corp., Billerica, MA, USA) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ; Сигма) анализ. Для анализа МТТ клетки культивировали в 6-луночном планшете, и в каждую лунку добавляли МТТ (3 мг / мл) (n = 4). Затем планшеты инкубировали в темноте при 37 ° С в атмосфере, содержащей 5% СО 2, в течение 2 часов, и супернатант отсасывали. Добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) и 6-луночный планшет медленно встряхивали в течение 5 минут. Поглощение измеряли при 570 нм.

Анализ ЛДГ

Активность LDH измеряли с использованием набора LDH-LQ (Asan Pharmaceutical Inc., Сеул, Корея). Вкратце, после 7 дней культивирования аликвоты по 20 мкл среды и 50 мкл рабочего раствора смешивали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали добавлением стоп-раствора (1 н. HCl) и поглощение измеряли при 570 нм.

Анализ ALP

Осаждение ALP измеряли с использованием набора для анализа щелочной фосфатазы SensoLyte ® p NPP (AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA). После подготовки образца образцы смешивали с раствором субстрата p NPP. Смеси инкубировали в течение 30–60 мин и добавляли стоп-раствор. Количество ALP количественно определяли с помощью ELISA при 405 нМ.

Результаты и обсуждение

Морфология и характеристика hBM-MSCs

HBM-MSC культивировали в остеогенной дифференцирующей среде и обрабатывали MP или подвергали воздействию EMF в течение 7 дней. Морфология hBM-MSCs во время остеогенеза в различных экспериментальных условиях [контроль (без обработки), включение MP, воздействие EMF, включение MP и воздействие EMF] показано в Рис. 2 , Никаких морфологических изменений или некроза hBM-MSCs не наблюдалось после индукции остеогенной дифференцировки ( Рис. 2 ). Следовательно, включение MP, воздействие EMF и включение MP в сочетании с воздействием EMF не вызывали каких-либо цитотоксических эффектов.

Иммуногистохимическое окрашивание

Для оценки уровней экспрессии белка в остеогенных маркерах и минерализации было проведено иммуногистохимическое окрашивание. Белок остеокальцина специфически синтезируется остеобластами и является маркером дифференцировки остеобластов на поздних стадиях формирования кости ( 11 ). Остеонектин - это гликопротеин в костях, который связывает натрий. Он выделяется остеобластами во время формирования кости, инициируя минерализацию и способствуя образованию минеральных кристаллов ( 12 ). Остеопонтин является высокофосфорилированным сиалопротеином, который является важным компонентом минерализованных внеклеточных матриц костей ( 13 ). Остеогенные маркеры (остеокальцин, остеопонтин и остеонектин) были сильно экспрессированы в клетках, обработанных МП, в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП, по сравнению с контрольной группой ( Рис. 3A – L ). Результаты иммуногистохимического окрашивания уровней экспрессии остеогенных маркеров представлены в Таблица II ,

Таблица II

Результаты окрашивания остеогенных маркеров.

Таблица II

Результаты окрашивания остеогенных маркеров.

Контрольный MP EMF MP + EMF Остеокальцин - + ++ ++ Остеонектин + ++ +++ +++ Остеопонтин + +++ ++ +++ фон Косса - ++ + ++

окрашивание фон Косса широко используется для количественной оценки минерализации ( 14 - 16 ). Обычно считается, что в методике фон Косса катионы серебра реагируют с фосфатами и карбонатами в отложениях кальция ( 17 ). Мы использовали окрашивание фон Косса для изучения минерализации hBM-MSCs во время остеогенеза ( Рис. 3M – P ). Необработанные hBM-MSC (контроль) или те, которые подвергались воздействию EMF, растущим в остеогенной среде, обнаруживали небольшое количество минерализации матрикса; однако, hBM-MSC, обработанные MP и обработанные MP и подвергшиеся воздействию EMF, показали более сильную минерализацию матрицы по сравнению с необработанными контролями на 7-й день. Количество минерализации в каждой группе обработки показано на Таблица II ,

РТ-КПЦР

Уровни экспрессии мРНК генов, связанных с остеогенезом, из hBM-MSCs после индукции остеогенной дифференцировки в течение 3 дней показаны на Рис. 4А , Маркеры остеобластов, остеокальцин, остеопонтин и остеонектин были высоко экспрессированы в hBM-MSC, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП. Мы также исследовали уровни экспрессии основных генов белка костного матрикса, таких как коллаген I, коллаген III, BMP-2 и BSP. BMP-2 индуцирует дифференцировку остеобластов, воздействуя непосредственно на MSC, и клинически используется для индукции формирования кости, хотя требуются большие дозы ( 18 ). BSP представляет собой сильно посттрансляционно модифицированный кислый фосфорный белок, обычно экспрессируемый в минерализованной ткани, такой как кость и дентин ( 19 ). Репрезентативные гены, связанные с остеогенезом, были в высокой степени экспрессированы в hBM-MSC, обработанных MP, тех, которые подвергались воздействию EMF, и тех, которые получали MP и подвергались воздействию EMF. Результаты наших экспериментов показали, что уровни экспрессии BSP, OPN, OCN и коллагена I были значительно увеличены в группе EMF с воздействием MP. Экспрессия остеогенного гена может использоваться в качестве раннего показателя во время остеогенеза. BSP является маркером поздней стадии дифференцировки остеобластов и маркером ранней стадии минерализации матрикса. OPN экспрессируется в течение всего периода созревания матрицы, затем следует BSP и, наконец, OCN, что характеризует фазу после размножения. Белок OCN специфически синтезируется остеобластами и является маркером дифференцировки остеобластов на более поздних стадиях формирования кости. Коллаген I является наиболее распространенным белком в костном матриксе и является ранним маркером остеобластической дифференцировки и основным органическим компонентом минерализованного костного матрикса. Кроме того, экспрессию мРНК фактора транскрипции Runx-2 измеряли с помощью RT-КПЦР. Runx-2 участвует в производстве белков костного матрикса, так как он способен усиливать экспрессию генов основных белков костного матрикса, приводя к увеличению количества незрелых остеобластов из плюрипотентных стволовых клеток; незрелые остеобласты образуют незрелую кость ( 20 - 25 ). Runx-2 был сильно выражен в hBM-MSC, обработанных MP, тех, кто подвергался воздействию EMF, и тех, кто подвергался воздействию MP и подвергался воздействию EMF по сравнению с необработанным контролем.

Недавние исследования показали, что активация кальция влияет на формирование кости. Клар и др. ( 26 ) сообщили, что спонтанная индукция образования кости инициируется локальным пиком дифференцировки активирующих кальций стволовых клеток и индукцией образования кости. Более того, Вен и др. ( 27 ) упомянул, что ингибирование напряжения-зависимого кальциевого канала L-типа (VDCCL) подавляет пролиферацию и остеогенную дифференцировку MSCs крысы (rMSC), но способствует апоптозу. Эти результаты позволяют предположить, что VDCCL играет решающую роль в пролиферации и остеогенной дифференцировке rMSC. Основываясь на этих знаниях, мы исследовали влияние воздействия MP и EMF на экспрессию генов, связанных с кальциевыми каналами, в МСК hBM во время остеогенеза. После 3 дней остеогенеза и лечения с использованием MP и EMF уровни экспрессии мРНК CACNA1C и CACNA1I в клетках, обработанных MP, в клетках, подвергшихся воздействию EMF, и в клетках, обработанных MP и воздействующими EMF, были несколько выше по сравнению с контрольной группой. ( Рис. 4B ). Кроме того, уровни экспрессии CACNA1E и CACNA1G были значительно выше в клетках, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП ( Рис. 4B ). Это говорит о том, что кальциевый канал hBM-MSC активировался во время остеогенной дифференцировки.

Вестерн-блот анализ

Для изучения остеогенной дифференцировки связанные с остеогенезом белки были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга на 7-й день индукции. Как показано в Рис. 5 уровни экспрессии белков, связанных с остеогенезом (BSP, BMP-2, остеопонтин и остеонектин), были повышены в клетках, обработанных МП, в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и в которых воздействовали ЭМП, по сравнению с контрольной группой.

Чтобы исследовать потенциальную активацию p-ERK во время остеогенеза, проводили вестерн-блот анализ. В нескольких исследованиях сообщалось, что активация p-ERK является важным медиатором индуцированной фактором роста пролиферации и дифференцировки клеток в клетках различных типов, включая остеобласты ( 28 - 31 ). Капур и др. ( 32 ) продемонстрировали, что активация ERK1 / 2 механическими стимулами участвует в синтезе коллагена и выработке остеопонтина. В настоящем исследовании, после 7 дней остеогенеза с включением MP и воздействием EMF, экспрессия p-ERK была увеличена, и она была высоко экспрессирована в клетках, обработанных MP и подвергающихся воздействию EMF ( Рис. 5 ).

Анализ FACS

Некоторые антигены известны как поверхностные маркеры MSC. Сообщалось, что антитела против CD73 (мембраносвязанной экто-5'-нуклеотисидазы), CD90 (Thy-1), CD105 (эндоглин) реагируют с недифференцированными MSC ( 33 - 35 ).

Чтобы выяснить, влияет ли включение MP и воздействие ЭМП на дифференциацию hBM-MSC, был проведен анализ FACS для маркеров hBM-MSC, CD73, CD90 и CD105 ( Рис. 6 ). Уровень экспрессии CD73 составил 91% в контрольной группе, 76% в группе включения МР, 88% в группе, подверженной воздействию ЭМП, и 77% в группе включения МП при воздействии группы ЭМП через 7 дней. Уровень экспрессии CD90 составлял 100% в контрольной группе, 94% в группе включения МР, 96% в группе, подверженной воздействию ЭМП, и 77% в группе включения МР при воздействии группы ЭМП. Экспрессия CD105 составила 95% в контрольной группе, 80% в группе включения МР, 92% в группе, подвергшейся воздействию ЭМП, и 77% в группе включения МП при воздействии группы ЭМП. Уровни экспрессии поверхностных антигенов hBM-MSC были снижены в клетках, обработанных МП, в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и в условиях воздействия ЭМП, по сравнению с контрольной группой. В заключение, наши данные указывают на то, что включение MP и воздействие EMF изменяют экспрессию поверхностного антигена MSC, предполагая, что hBM-MSCs дифференцируются в специфический тип клеток, таким образом изменяя их клеточную судьбу.

Анализ клеточной пролиферации и активности

Было определено, что количество клеток составляет примерно 3,4 × 10 5 клеток в контрольной группе, 3,7 × 10 5 клеток в группе включения МР, 3,1 × 10 5 клеток в группе, подвергшейся воздействию ЭМП, и 3,9 × 10 5 клеток в включении МП с воздействием группы ЭМП через 7 дней ( Рис. 7А ).

Как показывают результаты подсчета клеток, клетки, обработанные MP и клетки, обработанные MP и подвергшиеся воздействию EMF, демонстрировали слегка ускоренный рост клеток по сравнению с контрольной группой, в то время как группа, подвергавшаяся воздействию EMF, показала более замедленный рост клеток по сравнению с контрольной группой. ( Рис. 7А ).

Кроме того, жизнеспособность клеток и токсичность для hBM-MSC были измерены с помощью МТТ-анализа через 7 дней после остеогенеза. МТТ-анализ дает ценную информацию о потенциальной жизнеспособности клеток и цитотоксических эффектах. Хотя количество клеток уменьшилось после воздействия ЭМП и увеличилось после лечения МП и лечения МП в сочетании с воздействием ЭМП, митохондриальная активность клеток в 4 экспериментальных группах была сходной ( Рис. 7B ). Более того, эти результаты продемонстрировали, что цитотоксические эффекты не были обнаружены в hBM-MSC, обработанных МП, и в тех, которые подвергались воздействию EMF во время остеогенеза.

Активность ЛДГ и АЛП

ЛДГ является цитоплазматическим каталитическим ферментом, связанным с обратимым превращением пировиноградной и молочной кислот. ЛДГ выделяется через клеточную мембрану, когда она повреждена ( 36 ). Следовательно, меньшее выделение ЛДГ означает меньшее клеточное повреждение. Таким образом, среда была собрана и проанализирована через 7 дней с целью изучения повреждения клеток.

В клетках, обработанных МП, и в клетках, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП, наблюдалось снижение секреции ЛДГ ( Рис. 8А ). Активность ЛДГ в 4 экспериментальных группах была сходной, что свидетельствует о том, что лечение МП и воздействие ЭМП не влияли на секрецию ЛДГ и не вызывали повреждения клеточной мембраны.

ALP является ранним связанным с минерализацией белковым маркером для остеогенеза остеобластов ( 37 ). Эффекты включения MP и воздействия EMFs на клеточную активность ALP во время остеогенеза были изучены путем измерения продуктов реакции ALP в необработанных клетках (контроль), в клетках, обработанных MP, теми, которые подвергались воздействию EMF, и в тех, которые обрабатывались MP и подвергались воздействию ЭДС с течением времени. Несколько ALP-позитивных клеток наблюдали в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и подвергающихся воздействию ЭМП ( Рис. 8B ). Эти результаты предполагают, что включение MP в сочетании с воздействием EMFs увеличивает активность ALP в hBM-MSCs во время остеогенеза.

В заключение, в настоящем исследовании были изучены эффекты лечения МП в сочетании с воздействием ЭМП на дифференцировку клеток. Мы обрабатывали hBM-MSC с помощью 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP или подвергали их воздействию частоты 45 Гц и интенсивности 1 мТл ЭДС два раза в 8 часов в день в течение 7 дней. Во время остеогенеза морфологические изменения и цитотоксические эффекты не наблюдались. Экспрессию остеогенных маркеров определяли иммуногистохимическим окрашиванием, RT-КПЦР и вестерн-блоттингом, демонстрируя увеличение экспрессии. Анализ FACS показал, что обработка MP и воздействие ЭМП снижали экспрессию поверхностных маркеров MSC; это говорит о возможности дифференциации hBM-MSC. Минерализация hBM-MSCs в группе включения МР или в группе, подверженной воздействию ЭМП, наблюдалась с помощью анализа ALP. Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что лечение hBM-MSCs с помощью MP или их воздействия на EMF увеличивает остеогенную дифференцировку, и что включение MP в сочетании с воздействием EMF является более эффективным в усилении остеогенной дифференцировки. Результаты нашего исследования демонстрируют, что МП могут быть потенциально использованы для медицинских инструментов или материалов строительных лесов, и что ЭМП могут быть использованы для реабилитации остеогенных ран.

Подтверждения

Настоящее исследование было поддержано программой Исследовательского центра Pioneer через Национальный исследовательский фонд Кореи, финансируемый Министерством науки, ИКТ и планирования будущего, Республика Корея (грант № 2009-0082941).

Рекомендации

1

Садан О., Меламед Э. и Оффен Д. Терапия мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга при нейродегенеративных заболеваниях. Эксперт Опин Биол Тер. 9: 1487-1497. 2009. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

2

Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, Рейес M, Ленвик T, Лунд T, Блэкстад M, Du J, Олдрич С., Лисберг А, Low WC, Largaespada DA и Verfaillie C: Плюрипотентность мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга взрослого человека. Природа. 418: 41-49. 2002. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

3

Bielby R, Jones E и McGonagle D: роль мезенхимальных стволовых клеток в поддержании и восстановлении кости. Травма. 38 (Приложение 1): S26 – S32. 2007. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

4

Фукада Е и Ясуда I: о пьезоэлектрическом эффекте кости. J Phys Soc Japan. 12: 1158-1162. 1957. Посмотреть статью : Google ученый

5

Бассетт CA и Pawluk RJ: Влияние электрических токов на кости in vivo. Природа. 204: 652-654. 1964. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

6

Tsai MT, Li WJ, Tuan RS и Chang WH: модуляция остеогенеза в мезенхимальных стволовых клетках человека с помощью стимуляции специфическим импульсным электромагнитным полем. J Orthop Res. 27: 1169-1174. 2009. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

7

Sun LY, Hsieh DK, Lin PC, Chiu HT и Chiou TW: Импульсные электромагнитные поля ускоряют пролиферацию и экспрессию остеогенных генов в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга человека во время остеогенной дифференцировки. Bioelectromagnetics. 31: 209-219. 2010.

8

Pankhurst QA, Connolly J, Jones S и Dobson J: Применение магнитных наночастиц в биомедицине. J Phys D Appl Phys. 36: R167-R181. 2003. Посмотреть статью : Google ученый

9

Картмелл С.Х., Добсон Дж., Вершурен С.Б. и Эль-Хадж А.Дж .: Разработка методов магнитных частиц для длительной культуры костных клеток с прерывистой механической активацией. IEEE Trans Nanobioscience. 1: 92-97. 2002. Посмотреть статью : Google ученый

10

Чо Х, Чой Ю.К., Ли Д.Х., Парк Х.Дж., Сео Й.К., Юнг Х., Ким С.К., Ким С.М. и Пак Дж.К .: Влияние магнитных стволовых клеток человеческого мозга, полученных из наночастиц, под воздействием импульсных электромагнитных полей на позвоночник поврежденной крысы шнур. Биотехнология Аппл Биохем. 60: 596-602. 2013. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

11

Ducy P, Десбуа C, Бойс B, Пинеро G, Стори B, Dunstan C, Смит E, Бонадио J, Гольдштейн S, Гундберг C, Брэдли A и Карсенти G: Повышенное образование кости у мышей с дефицитом остеокальцина. Природа. 382: 448-452. 1996. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

12

Kelm RJ Jr, Hair GA, Mann KG и Grant BW: характеристика остеобластов человека и остеонектина, полученного из мегакариоцитов (SPARC). Кровь. 80: 3112-3119. 1992. PubMed / NCBI

13

Содек Дж, Гансс Б и Макки М: Остеопонтин. Crit Rev Oral Biol Med. 11: 279-303. 2000. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

14

von Kossa J: Uber die im Organismus künstlich erzeugbaren Verkalkungen. Бейт Путь Анат. 29: 163-202. 1901 г. (на немецком языке).

15

Законопроекты C, Eisenberg H и Pallante SL: Комплексы органических кислот с фосфатом кальция: пятно фон Косса как ключ к составу костного минерала. Johns Hopkins Med J. 128: 194–207. 1971. PubMed / NCBI

16

Пухтлер Х. и Мелоан С. О химии фиксации формальдегида и ее влиянии на иммуногистохимические реакции. Гистохимия. 82: 201-204. 1985. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

17

Мелан С. Н. и Пухтлер Х. Химические механизмы методов окрашивания: метод фон Коссы: что на самом деле написал фон Косса, и модифицированная реакция для селективной демонстрации неорганических фосфатов. J Histotechnol. 8: 11-13. 1985. Посмотреть статью : Google ученый

18

Schwartz Z, Саймон B, Duran M, Barabino G, Chaudhri R и Boyan B: Импульсные электромагнитные поля усиливают BMP-2-зависимую остеобластическую дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток человека. J Orthop Res. 26: 1250-1255. 2008. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

19

Шварц З., Ломанн С., Офингер Дж., Боневальд Л., Дин Д. и Боян Б. Характеристики поверхности имплантата модулируют дифференцировочное поведение клеток в линии остеобластов. Adv Dent Res. 13: 38-48. 1999. Посмотреть статью : Google ученый

20

Огава Е., Инузука М., Маруяма М., Сатаке М., Найто-Фуджимото М., Ито Y и Шигесада К. Молекулярное клонирование и характеристика PEBP2β, гетеродимерного партнера нового ДНК-связывающего белка Drosophila runt, связывающего ДНК PEBP2α. Вирусологии. 194: 314-331. 1993. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

21

Миёси Х, Шимицу К, Козу Т, Масеки Н., Канеко Y и Оки М: t (8; 21) точки останова на хромосоме 21 при остром миелобластном лейкозе сгруппированы в ограниченной области одного гена, AML1. Proc Natl Acad Sci USA. 88: 10431-10434. 1991. Посмотреть статью : Google ученый

22

Комори Т, Яги Х, Номура С, Ямагути А, Сасаки К, Дегучи К, Симидзу Y, Бронсон Р, Гао ЙХ, Инада М, Сато М, Окамото Р, Китамура Й, Йошики С и Кишимото Т: Целевое нарушение результатов Cbfa1 при полном отсутствии костеобразования вследствие остановки созревания остеобластов. Cell. 89: 755-764. 1997. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

23

Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL и Karsenty G: Osf2 / Cbfa1: транскрипционный активатор дифференцировки остеобластов. Cell. 89: 747-754. 1997. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

24

Отто Ф., Торнелл А.П., Кромптон Т., Дензел А., Гилмор К.С., Розуэлл И.Р., Стамп Г.В., Беддингтон Р.С., Мундлос С., Олсен Б.Р., Селби П.Б. и Оуэн М.Дж .: Cbfa1, кандидатный ген для синдрома клеидокраниальной дисплазии, необходим для остеобласта дифференциация и развитие костей. Cell. 89: 765-771. 1997. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

25

Комори Т: Регуляция развития генов белка и генов внеклеточного матрикса с помощью RUNX2. Cell Tissue Res. 339: 189-195. 2010. Посмотреть статью : Google ученый

26

Klar RM, Duarte R, Dix-Peek T, Dickens C, Ferretti C и Ripamonti U: Ионы кальция и остеокластогенез инициируют образование костной ткани с помощью полученных из кораллов макропористых конструкций. J Cell Mol Med. 17: 1444-1457. 2013. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

27

Wen L, Wang Y, Wang H, Kong L, Zhang L, Chen X и Ding Y: Кальциевые каналы L-типа играют решающую роль в пролиферации и остеогенной дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Biochem Biophys Res Commun. 424: 439-445. 2012. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

28

Lai CF, Chaudhary L, Fausto A, Halstead LR, Ory DS, Avioli LV и Cheng SL: Erk необходим для роста, дифференцировки, экспрессии интегрина и клеточных функций в клетках остеобластов человека. J Biol Chem. 276: 14443-14450. 2001. PubMed / NCBI

29

Азума Н., Дузгун С.А., Икеда М., Кито Н., Акасака Н., Сасаджима Т. и Сумпио Б.Е .: Ответ эндотелиальных клеток на различные механические силы. J Vasc Surg. 32: 789-794. 2000. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

30

Олденхоф А.Д., Шинлова О.П., Лю М., Лангилл Б.Л. и Лай С.Дж. Активированные митогеном протеинкиназы опосредуют вызванную растяжением экспрессию мРНК c-fos в клетках гладких мышц миометрия. Am J Physiol Cell Physiol. 283: C1530-C1539. 2002. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

31

Ferraro JT, Daneshmand M, Bizios R и Rizzo V: истощение холестерина в плазматической мембране снижает гидростатическое давление и вызванные сдвиговым стрессом пути механотрансдукции в культурах остеобластов. Am J Physiol Cell Physiol. 286: C831-C839. 2004. Посмотреть статью : Google ученый

32

Kapur S, Baylink DJ и Lau KH: напряжение сдвига в потоке жидкости стимулирует пролиферацию и дифференцировку остеобластов человека посредством множества взаимодействующих и конкурирующих путей передачи сигнала. Кость. 32: 241-251. 2003. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

33

Schieker M, Pautke C, Haasters F, Schieker J, Docheva D, Böcker W, Guelkan H, Neth P, Jochum M и Mutschler W: мезенхимальные стволовые клетки человека на одноклеточном уровне: одновременная иммунофлюоресценция из семи цветов. J Анат. 210: 592-599. 2007. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

34

Барри Ф.П. и Мерфи Дж. Мезенхимальные стволовые клетки: клиническое применение и биологическая характеристика. Int J Biochem Cell Biol. 36: 568-584. 2004. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

35

Бобис С, Яроха Д и Майка М: Мезенхимальные стволовые клетки: характеристика и клиническое применение. Фоли Гистохим Цитобиол. 44: 215-214. 2007. PubMed / NCBI

36

Mitchell DB, Santone KS и Acosta D. Оценка цитотоксичности в культивируемых клетках по утечке фермента. J Методы культа ткани. 6: 113-116. 1980. Посмотреть статью : Google ученый

37

Gundberg C, Looker A, Nieman S и Calvo M: паттерны остеокальцина и костной щелочной фосфатазы в зависимости от возраста, пола, расы или этнической принадлежности. Кость. 31: 703-708. 2002. Посмотреть статью : Google ученый

Похожие

Комментарии