Измерение потока кальция на FACSVantage SE с использованием индо

Измерение потока кальция на FACSVantage SE с использованием индо-1.

Ратиометрический кальциевый зонд индо-1 (форма эфира AM) может быть загружен в клетки для анализа потока кальция после стимуляции клеток. Обнаружение соотношения между связанным индо-1 и свободным индо-1 (и, следовательно, относительной внутриклеточной концентрацией кальция) может быть выполнено на FACSVantage с использованием источника УФ-лазера для возбуждения индо-1 и узких 390/20 и 495/20 нм. полосовые фильтры для обнаружения связанной и свободной индо-1 флуоресценции соответственно. Мы можем обнаружить индо-1, используя одну из двух настольных конфигураций.

Во-первых, в качестве источника возбуждения мы используем аргон-ионный лазер в основном положении, настроенный на многолинейный УФ-выход (100 мВт). Свободные и связанные формы индо-1 затем обнаруживаются в PMT FL1 и FL2 (обычно FITC и PE) с использованием вышеупомянутых полосовых фильтров и 460 длиннопроходного дихроика с расширенной передачей для разделения сигналов. Все остальные дихроики на пути прохождения сигнала удаляются. Хотя для разделения сигнала бокового рассеяния можно использовать дихроику с длиной волны 380 (как мы делаем с обнаружением AMCA от первичного лазера), мы обнаружили, что он несколько уменьшает силу сигнала 390 нм; следовательно, мы опускаем это. Полосовой фильтр 488/10 снимается с фотодиода прямого рассеяния для облегчения обнаружения рассеяния с использованием УФ-лазера. Выравнивание проводят с использованием Hoechst 33342-меченных куриных эритроцитов или Polyscience Синие Бусы. Мы используем Cytek Кинетический модуль Time Zero для добавления реагентов в ячейки онлайн.

(Ниже). Конфигурация оптического стенда для обнаружения индо-1 с использованием первичного пути луча . Indo-1 возбуждается первичным аргон-ионным лазером, настроенным на многолинейное УФ. Узкополосные фильтры шириной 390/20 и 495/20 нм (изготавливаются на заказ Chroma Technology ) используются для обнаружения связанного и свободного индо-1 соответственно, эти два сигнала разделены длинноходовым дихроиком 460 (изготовленным с расширенной передачей до диапазона 390 нм). Все остальные дихроики удаляются с оптического пути, а отверстия закрываются. Дихроичный 380 LP, обычно используемый для обнаружения SS от УФ-лазера, для индо-1 опущен, поскольку он снижает чувствительность. Фильтр 488 нм также удален из фотодиода прямого рассеяния.

(Ниже). Наш кинетический модуль Cytek Time Zero установлен на нашем FACSVantage SE. Мы используем подачу воздуха для инструментов, чтобы обеспечить нормальную камеру пробы и наддувочный воздух.

(Ниже). Моноциты человека, нагруженные индо-1 АМ ( Молекулярные зонды ) в 3 мкМ при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут и проанализировали на FACSVantage, используя вышеуказанную конфигурацию фильтра. Иономицин в концентрации 1 М добавляли к популяции клеток в режиме онлайн с использованием Cytek Модуль кинетики Time Zero через 30 секунд после начала сбора данных. Точечные диаграммы слева показывают флуоресцентное излучение при 390 нм (связанный индо-1) и 495 нм (свободный индо-1). Обе длины волн были собраны в линейном масштабе. График справа показывает соотношение между 390 и 495 нм.

С установкой нашего обновления FACSVantage SE (с тремя путями луча) мы теперь можем возбуждать индо-1 с лазера на третичном криптоне с ионами, настроенного на многолинейный УФ , сохраняя первичный луч при 488 нм для прямого рассеяния и одновременного иммунофенотипирования. Индо-1 фильтры такие же, как те, которые используются для первичного лазерного детектирования индо-1. Расстояние между первичным и третичным сигнальными трактами позволяет использовать первичный лазер на длине волны 488 нм с небольшим распространением лазерного излучения в третичные ФЭУ.

(Ниже). Конфигурация оптического стенда для обнаружения индо-1 с использованием пути третичного пучка . В этой установке индо-1 возбуждается третичным криптон-ионным лазером, настроенным на многолинейное УФ. Узкополосные фильтры шириной 390/20 и 495/20 нм, описанные выше, используются для обнаружения связанного и свободного индо-1 соответственно, двух сигналов, разделенных длинноходовым дихроиком 460. Оба сигнала перенаправляются на третичные ФЭУ с 3-сторонним 100% зеркалом. Особое внимание следует уделить правильному выравниванию лазера, поскольку первичный лазерный луч с длиной волны 488 нм может перетекать в PMT третичного пути. Это не должно происходить, если лазерные лучи и пути прохождения сигнала достаточно разнесены. Боковое рассеяние может быть обнаружено с использованием первичного луча с длиной волны 488 нм, хотя зеркало частичного отражения, обычно используемое для отклонения сигнала бокового рассеяния, может быть удалено для улучшения чувствительности определения индо-1. , Прямое рассеяние может быть обнаружено как нормальное с первичным лазером и фильтром 488/10 нм.

(Ниже). Клетки мышиных EL4 загружали индо-1 AM при 5 мкМ при 37 ° С в течение 30 минут и анализировали на FACSVantage с использованием описанной выше конфигурации фильтра. Иономицин в концентрации 1 М добавляли к популяции клеток в режиме онлайн с использованием Cytek Модуль кинетики Time Zero через 30 секунд после начала сбора данных. Точечные диаграммы слева показывают флуоресцентное излучение при 390 нм (связанный индо-1), 495 нм (свободный индо-1) и соотношение между двумя длинами волн. Обе длины волн были собраны в линейном масштабе. График справа показывает соотношение между 390 и 490 нм.

Возбуждение индо-1 от криптонового третичного лазера позволяет нам использовать первичный лазер для возбуждения одного или нескольких ФЭУ. FITC трудно использовать с индо-1, поскольку их спектры излучения перекрываются, что приводит к перекрестным помехам в сигнале; однако PE, PE-Cy5 и APC могут использоваться в качестве флуоресцентных меток с иммунологической меткой одновременно с индо-1 (APC от пучка HeNe 632 нм). Затем можно измерить поток кальция, специфичный для фенотипа.

(Ниже). Конфигурация оптического стенда для обнаружения индо-1 с использованием пути третичного пучка и ПЭ с использованием первичного лазера. Эта установка идентична приведенной выше с добавлением анализа PE в FL2.

(Ниже). Клетки мышиных EL4.153.1 (отобранные по типу CD153) загружали индо-1 при 5 мкМ при 37 ° С в течение 30 минут, промывали и затем иммунизировали PE-анти-CD153 ( Caltag ) в течение 20 минут. Затем клетки анализировали на FACSVantage с использованием вышеуказанной конфигурации фильтра. Гистограмма слева показывает флуоресценцию PE-CD153, которая является положительной для всей популяции, но варьируется от низкой до высокой. На трехмерных точечных графиках (посередине, контроль изотипа; справа, PE-CD153) показана экспрессия PE-CD153 на оси X, а также связанных и свободных индо-1-сигналов на осях Z и Y соответственно). Добавление иономицина приводит к сдвигу сигнала от свободного к связанному индо-1; Поток кальция в CD153 с низкой (синей) и высокой (зеленой) субпопуляциями отчетливо виден.

Нажмите Вот увидеть индо-1 на BD LSR, настольном проточном цитометре, оснащенном УФ-лазером HeCad.

Вернитесь на домашнюю страницу NCI ETIB Flow Lab.

Похожие

Комментарии