Категории

  • Видеокарты
  • Ноутбук Asus клавиатуры
  • Audiотехника
  • Android контакты
  • Ноутбук Asus характеристики
  • Новости
  • Новости

    На этом сайте
    В нашем случае необходимо подбирать ключевые слова под каждый свой товар, каждое изделие. Например, вы продаете вязаный плед спицами. Сейчас я на примере покажу как это делается. Сначала мы поработаем

    Беспроводной проектор
    Если бросить взгляд на историю Типов, даже очень поверхностный, можно сказать, что Рефлекторы - первичный тип. Это очевидно, потому что вся живая природа наделена рефлекторскими качествами. Все формы

    Франшизы в украине
    Если говорить о самых прибыльных франшизах, то стоит отметить, что многие из представленных в 2018 году на франчайзинговом рынке такие находятся в топе лучших предложений в течение длительного времени.

    Аудит сайта онлайн бесплатно
    Для проведения аудита сайта мы будем пользоваться большим количеством разных сервисов. И начнем, пожалуй, с одного сервиса, который меньше всего известен среди «любителей». Этот сервис называется Букварикс.

    Типы ссылок seo
    SEO-студия, которая не дает объяснений о том, что именно оно делает — опасно. Это сигнал того, что там есть « серые» или даже « черные» методы продвижения, и в любом случае —

    Накрутка просмотров ютуб
    Приветствую, друзья! Все вы, наверняка, знаете такой существующий, в виртуальном мире от YouTube, парадокс, который заключается в том, что если у вашего, недавно размещённого тут ролика, ещё совсем нет

    Ассортимент лазерных ротационных нивелиров
    При современных строительных, а так же ремонтных и монтажных работах практически не используется то оборудование, без которого эти работы раньше просто не велись. Ушли в прошлое отвесы в виде грузика

    Хороший бизнес форум
    Нашим продвинутым по жизни современникам понятно, что вопрос заработка, для тех, кто не против подумать своей головой и поработать, не является чем-то сложным. В наше время каждый имеет прекрасную возможность

    GPS мониторинг транспорта и контроль топлива
    Ни для кого не секрет, что система спутникового GPS мониторинга стоит костью в горле для нечестных на руку водителей. Как показывают исследования, каждый рейс опытный водитель может завышать расход топлива

    Чехол Xiaomi Redmi 6a
    Самое интересное, что указанное обновление, кроме остальных функций и возможностей, добавляет темную тему почти для трех десятков смартфонов Xiaomi и Redmi. Среди устройств, которым доступна прошивка,

    Электромагнитные поля и наномагнитные частицы увеличивают остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека

    1. Вступление Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой широко используемые взрослые стволовые клетки, которые обладают потенциалом самообновления и способностью к мультипотентной дифференцировке клеток. В частности, мезенхимальные стволовые клетки человеческого костного мозга (hBM-MSCs) были экспериментально использованы в ряде клеточных терапий и в регенеративной медицине из-за их обильных и неонкогенных свойств ( 1 ). hBM-MSC обладают способностью дифференцироваться в различные типы клеток, такие как фибробласты, хондроциты, адипоциты и остеобласты ( 2 ). Кроме того, hBM-MSCs играют важную роль в восстановлении кости ( 3 ). Предыдущие исследования показали, что регенерация кости происходит после электростимуляции и приводит к развитию кости ( 4 , 5 ). На основании этих знаний было исследовано влияние электромагнитных полей (ЭМП) на остеогенез. Недавно было сообщено, что чрезвычайно низкая частота стимуляции ЭМП играет существенную роль в остеогенной дифференцировке и пролиферации hBM-MSCs. Цай и др. ( 6 ) продемонстрировали, что воздействие крайне низкой частоты ЭМП (7,5 Гц) играет модулирующую роль в остеогенной дифференцировке hBM-MSCs с увеличением уровней щелочной фосфатазы (ALP). Sun et al ( 7 ) продемонстрировали, что частота 15 Гц ЭДС увеличивала экспрессию генов, связанных с остеогенезом, в hBM-MSC. Наномагнитные частицы (МП) широко используются в биомедицине. Депутаты могут применяться для доставки лекарств, биологических меток и обнаружения белков благодаря их контролируемому размеру и магнитным свойствам ( 8 ). Картмелл и др. ( 9 ) сообщили, что механическая стимуляция первичных остеобластов человека с помощью технологии магнитных частиц влияла на остеобластическую активность. В настоящем исследовании MP оксида железа (Fe 3 O 4) были инкапсулированы в оболочку из полиэтиленгликоля (PEG) -фосфолипида для улучшенной биосовместимости. В настоящем исследовании мы исследовали влияние воздействия ЭМП и лечения Fe 3 O 4 MP на остеогенную дифференциацию hBM-MSCs. hBM-MSC обрабатывали 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP или подвергали воздействию частоты 45 Гц с интенсивностью 1 мТл ЭДС дважды каждые 8 ​​часов в день в течение 7 дней. Мы также исследовали, является ли лечение Fe 3 O 4 MP в сочетании с воздействием ЭМП более эффективным для усиления остеогенной дифференцировки. Остеогенную дифференциацию анализировали иммуногистохимическим окрашиванием, вестерн-блоттингом, количественной обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) и измерением активности ALP. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в 4 экспериментальных группах была сходной; это говорит о том, что лечение не влияло на секрецию ЛДГ и не вызывало повреждения клеточной мембраны. материалы и методы
    2. Остеогенная дифференциация hBM-MSCs
    3. Воздействие ЭМП
    4. Подготовка и характеризация Fe3O4 MPs
    5. Иммуногистохимическое окрашивание
    6. окрашивание фон Косса
    7. РТ-КПЦР
    8. Таблица I
    9. Таблица I
    10. Вестерн-блот анализ
    11. Анализ антигена клеточной поверхности методом флуоресцентной сортировки клеток (FACS)
    12. Анализ пролиферации и активности hBM-MSCs
    13. Анализ ЛДГ
    14. Анализ ALP
    15. Результаты и обсуждение
    16. Иммуногистохимическое окрашивание
    17. Таблица II
    18. Таблица II
    19. РТ-КПЦР
    20. Вестерн-блот анализ
    21. Анализ FACS
    22. Анализ клеточной пролиферации и активности
    23. Активность ЛДГ и АЛП
    24. Подтверждения
    25. Рекомендации

    Вступление

    Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой широко используемые взрослые стволовые клетки, которые обладают потенциалом самообновления и способностью к мультипотентной дифференцировке клеток. В частности, мезенхимальные стволовые клетки человеческого костного мозга (hBM-MSCs) были экспериментально использованы в ряде клеточных терапий и в регенеративной медицине из-за их обильных и неонкогенных свойств ( 1 ). hBM-MSC обладают способностью дифференцироваться в различные типы клеток, такие как фибробласты, хондроциты, адипоциты и остеобласты ( 2 ). Кроме того, hBM-MSCs играют важную роль в восстановлении кости ( 3 ).

    Предыдущие исследования показали, что регенерация кости происходит после электростимуляции и приводит к развитию кости ( 4 , 5 ). На основании этих знаний было исследовано влияние электромагнитных полей (ЭМП) на остеогенез. Недавно было сообщено, что чрезвычайно низкая частота стимуляции ЭМП играет существенную роль в остеогенной дифференцировке и пролиферации hBM-MSCs. Цай и др. ( 6 ) продемонстрировали, что воздействие крайне низкой частоты ЭМП (7,5 Гц) играет модулирующую роль в остеогенной дифференцировке hBM-MSCs с увеличением уровней щелочной фосфатазы (ALP). Sun et al ( 7 ) продемонстрировали, что частота 15 Гц ЭДС увеличивала экспрессию генов, связанных с остеогенезом, в hBM-MSC.

    Наномагнитные частицы (МП) широко используются в биомедицине. Депутаты могут применяться для доставки лекарств, биологических меток и обнаружения белков благодаря их контролируемому размеру и магнитным свойствам ( 8 ). Картмелл и др. ( 9 ) сообщили, что механическая стимуляция первичных остеобластов человека с помощью технологии магнитных частиц влияла на остеобластическую активность. В настоящем исследовании MP оксида железа (Fe 3 O 4) были инкапсулированы в оболочку из полиэтиленгликоля (PEG) -фосфолипида для улучшенной биосовместимости.

    В настоящем исследовании мы исследовали влияние воздействия ЭМП и лечения Fe 3 O 4 MP на остеогенную дифференциацию hBM-MSCs. hBM-MSC обрабатывали 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP или подвергали воздействию частоты 45 Гц с интенсивностью 1 мТл ЭДС дважды каждые 8 ​​часов в день в течение 7 дней. Мы также исследовали, является ли лечение Fe 3 O 4 MP в сочетании с воздействием ЭМП более эффективным для усиления остеогенной дифференцировки. Остеогенную дифференциацию анализировали иммуногистохимическим окрашиванием, вестерн-блоттингом, количественной обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) и измерением активности ALP. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в 4 экспериментальных группах была сходной; это говорит о том, что лечение не влияло на секрецию ЛДГ и не вызывало повреждения клеточной мембраны.

    материалы и методы

    Культура клеток

    hBM-MSC были приобретены в Lonza (Базель, Швейцария) и содержались в культуре в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Welgene, Тэджон, Корея) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Lonza), 1% пенициллина / стрептомицина (PS ; Welgene), 25 мкМ 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в инкубаторе с температурой 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2. HBM-MSC использовали из пассажей 4-7 с аналогичными результатами, полученными повсюду.

    Остеогенная дифференциация hBM-MSCs

    Остеогенная дифференцирующая среда состояла из DMEM (Welgene) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Lonza), 1% пенициллина / стрептомицина (PS; Welgene), 10 мМ β-глицерофосфата (Sigma-Aldrich), 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат (Sigma-Aldrich) и 100 нМ дексаметазон (Sigma-Aldrich). Среду меняли каждые 2–3 дня.

    Воздействие ЭМП

    Схематическое изображение синусоидального устройства ЭДС представлено в рисунок 1 , Устройство ЭДС было помещено в инкубатор при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2.

    Блок стимуляции предназначен для работы с парой одинаковых катушек диаметром 30 см, собранных в конфигурации Гельмгольца. Пара катушек работает на переменном токе, генерируя ЭДС. Ток в катушке контролируется генератором. Приложенное магнитное поле состояло из частоты 45 Гц и интенсивности 1 мТл два раза каждые 8 ​​часов в день в течение 7 дней. Клетки высевали в чашку для культивирования или чашку.

    Подготовка и характеризация Fe3O4 MPs

    Вододиспергируемые и биосовместимые Fe 3 O 4 MP были приготовлены с использованием метода, описанного ранее с некоторыми модификациями ( 10 ). Монодисперсные Fe 3 O 4 MP были диспергированы в неполярном органическом растворителе и синтезированы с использованием высокотемпературной реакции в фазе органического раствора. Железо (III) ацетилацетонат (Fe (acac) 3, 2 ммоль; 99,9%), 1,2-гексадекандиол (10 ммоль; 90%), олеиновая кислота (6 ммоль; 99%), олеиламин (6 ммоль; 70%) и 1-октадецен (20 мл; 90%) (все от Sigma-Aldrich) смешивали и магнитно перемешивали в атмосфере азота. Смесь нагревали до 200 ° C в течение 2 часов и затем нагревали до температуры кипения с обратным холодильником (~ 300 ° C) в течение дополнительного часа. Смесь черного цвета охлаждали до комнатной температуры. Этанол (40 мл) добавляли к смеси в условиях окружающей среды, и черный материал осаждали и отделяли центрифугированием (12000 об / мин, 30 мин). Черный продукт повторно диспергировали в гексане в присутствии олеиновой кислоты (~ 0,05 мл) и олеиламина (~ 0,05 мл). Центрифугирование (6000 об / мин, 10 мин) применяли для удаления любого недиспергированного остатка. Затем продукт осаждали этанолом, центрифугировали (10000 об / мин, 20 мин) для удаления растворителя и повторно диспергировали в органических растворителях, таких как н-гексан и хлороформ. Полученные Fe 3 O 4 MP, диспергированные в хлороформе, инкапсулировали в PEG-фосфолипидную оболочку, чтобы сделать их биосовместимыми. Обычно 2 мл органического диспергируемого Fe 3 O 4 MP размером 12 нм в хлороформе (5 мг / мл) смешивали с 1 мл раствора хлороформа, содержащего 10 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (PEG) -2000] (mPEG-2000 PE) (Avanti Polar Lipids, Inc.) в соотношении 5: 1. После полного выпаривания хлороформа остаток инкубировали при 80 ° C в вакууме в течение 1 часа. Добавляли пять миллилитров воды, что давало прозрачную темно-коричневую суспензию, содержащую мицеллы ПЭГ-РЕ. Поскольку эта суспензия содержала как пустые мицеллы, так и мицеллы, содержащие МП, пустые мицеллы удаляли ультрацентрифугированием. Мицеллы, содержащие МП, образовывали осадок, тогда как пустые мицеллы оставались суспендированными. Супернатант отбрасывали, а мицеллы МР ресуспендировали в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS). В настоящем исследовании 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP были добавлены в среду для остеогенной дифференцировки.

    Иммуногистохимическое окрашивание

    Клетки, культивируемые на покровном стекле, фиксировали в течение 20 мин при 4 ° С, используя 10% формалин с нейтральным буфером, и затем 3 раза промывали PBS (рН 7,2). Эти покровные стекла затем инкубировали с антиостеокальцином (предварительное разведение, AM 386; BioGenex, Сан-Рамон, Калифорния, США), антиостеопонтином (разведение 1: 1000) и антиостеонектином (разведение 1: 500; AB 1858, Chemicon, Карлсбад, Калифорния, США) антитела в течение 24 часов с последующей разработкой с использованием реагента EnVision Plus (Dako, Carpinteria, CA, USA), диаминобензидина в качестве хромогена и гематоксилина Майера в качестве контрстейна.

    окрашивание фон Косса

    Минерализованный матрикс клеток оценивали, используя 5% нитрат серебра (Sigma-Aldrich) в ультрафиолетовом свете в течение 60 минут, с последующим добавлением 3% тиосульфата натрия (Sigma-Aldrich) в течение 5 минут и затем окрашивая Ван Гизоном (Сигма-Олдрич) в течение 5 мин. При таком способе окрашивания минеральная матрица окрашивается в черный цвет, а остеоид (неминерализованная матрица) окрашивается в красный цвет.

    РТ-КПЦР

    Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием 500 мкл реагента TRIzol (Sigma-Aldrich). Затем добавляли 100 мкл хлороформа и раствор перемешивали и инкубировали в течение 3 минут. После центрифугирования (12000 об / мин, 4 ° С в течение 15 мин) верхнюю фазу переносили в новую пробирку и добавляли 500 мкл изопропанола. После 10-минутного инкубационного периода и еще одной стадии центрифугирования (14000 об / мин, 4 ° С в течение 10 минут) супернатант отбрасывали. Осадок промывали 1 мл 70% этанола и центрифугировали (9500 об / мин, 4 ° С в течение 5 минут). Супернатант отбрасывали, а осадок сушили. После добавления 20 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), осадок растворяли в течение 10 минут на льду. Количество и чистоту суммарной РНК определяли с использованием нанодроп-спектрофотометра (Национальный университет Хэнкионг). Реакции обратной транскриптазы (RT) использовали для синтеза кДНК из 1 мкг общей РНК с использованием набора Advantage RT-for-RCR (Clontech Laboratories, Inc., Пало-Альто, Калифорния, США). ОТ-ПЦР проводилась регулярно. Образец охлаждали до -20 ° С и хранили до дальнейшего анализа. Для ПЦР праймеры были приобретены у Bioneer Corp. (Deajeon, Корея). Последовательности праймеров, используемые для количественной ПЦР, перечислены в Таблица I ,

    Последовательности праймеров, используемые для количественной ПЦР, перечислены в   Таблица I   ,

    Таблица I

    Праймеры использовали для RT-КПЦР.

    Таблица I

    Праймеры использовали для RT-КПЦР.

    Гены Последовательность праймера вверх по течению Последовательность праймера вниз по течению GAPDH 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACC 3 '5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3 ′ Коллаген I 5′-GAA AAC ATC CCA GCC AAG AA-3 ′ 5 ′ -CAG GTT GCC AGT CTC CTC AT-3 ′ Коллаген III 5′-CAG GTG AAC GTG GAG CTG C-3 ′ 5′-TGC CAC ACG TGT TTC CGT GG-3 ′ Остеонектин 5′-CCA GAA CCA CCA CTG CAA CAA AC-3 ′ 5′-GGC AGG AAG AGT CGA AGG TC-3 ′ Остеокальцин 5′-AGG GGA AGA GGA AAG AAG GG-3 ′ 5′-CCA GGC GCT ACC TGT ATC AA-3 ′ Остеопонтин 5′-TCG CAG ACC TGA CAT CCA GT-3 ′ 5′-TCG GAA TGC TCA TTG CTC TC-3 ′ BMP-2 5′-GTC CAG CTG TAA GAG ACA CC-3 ′ 5′-GTA CTA GCG ACA CCC ACA AC-3 ′ Runx-2 5'-CTC ACT ACC ACA CCT ACC TG-3 ′ 5′-TCA ATA TGG TCG CCA AAC AGA TTC-3 ′ BSP 5′-CAC AGC CTC ATC TTC ATG G-3 ′ 5′-GCA TCT CAT AGT GCA TCT GG-3 ′ CACNA1C 5′-ACA GTG ACC AGT GTG GTG GA-3 ′ 5′-CGT AGC CTC TGG AGA ACC TG-3 ′ CACNA1E 5′-GTT CGG CCG CGA TCA CCT TTG T-3 ′ 5 ′ -GGC GGC CAA TCG ATG AGC TTC T-3 ′ CACNA1G 5′-CGG CAA CTAC GTG CTC TTC A-3 ′ 5′-GTG ACT TCA TCT CGT GGG CC-3 ′ CACNA1I 5′-CGT TGT CAT AGC GAC CCA GTT-3 ′ 5′-CAC AGC TCT CTT CCC CGA GTG A-3 ′

    Вестерн-блот анализ

    Через 10 дней культивирования клеток клетки лизировали буфером RIPA, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS (Sigma-Aldrich), ингибиторы протеазы. (Complete ™; Roche Diagnostics, Мангейм, Германия). Белок (30 мкг) затем разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и промокали на нитроцеллюлозные мембраны, которые затем блокировали 5% обезжиренным молоком в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,2% Твин-20. Вестерн-блот-анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя (Abcam, Cambridge, MA, USA) со следующими первичными антителами: анти-костный сиалопротеин (BSP, ab52128; Abcam), анти-костный морфогенетический белок 2 (BMP-2, ab17885; Abcam), анти-остеопонтин (ab63856; Abcam), анти-остеонектин (ab14174; Abcam), антифосфорилированная внеклеточная регулирующая сигнал киназа (p-ERK, # 9101; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) и анти- актин (ab3280; Abcam). Блоты инкубировали с первичными антителами в разведении 1: 5000, а затем инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (# 7076; Cell Signaling Technology).

    Анализ антигена клеточной поверхности методом флуоресцентной сортировки клеток (FACS)

    Антитела против человеческих антигенов, CD73 и CD90, были приобретены у BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния, США), а антитело против CD105 было приобретено у Ancell Corp. (Бейпорт, Миннесота, США). В общей сложности 5 × 10 5 клеток ресуспендируют в 200 мкл PBS и инкубируют с антителами, конъюгированными с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) или фикоэритрином (PE), в течение 20 минут при комнатной температуре (или в течение 45 минут при 4 ° C). Интенсивность флуоресценции клеток оценивали с использованием проточного цитометра (FACScan; BD Biosciences), а данные анализировали с использованием программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).

    Анализ пролиферации и активности hBM-MSCs

    Пролиферацию и активность клеток измеряли с использованием счетчика клеток (Scepter ™; Millipore Corp., Billerica, MA, USA) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ; Сигма) анализ. Для анализа МТТ клетки культивировали в 6-луночном планшете, и в каждую лунку добавляли МТТ (3 мг / мл) (n = 4). Затем планшеты инкубировали в темноте при 37 ° С в атмосфере, содержащей 5% СО 2, в течение 2 часов, и супернатант отсасывали. Добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) и 6-луночный планшет медленно встряхивали в течение 5 минут. Поглощение измеряли при 570 нм.

    Анализ ЛДГ

    Активность LDH измеряли с использованием набора LDH-LQ (Asan Pharmaceutical Inc., Сеул, Корея). Вкратце, после 7 дней культивирования аликвоты по 20 мкл среды и 50 мкл рабочего раствора смешивали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали добавлением стоп-раствора (1 н. HCl) и поглощение измеряли при 570 нм.

    Анализ ALP

    Осаждение ALP измеряли с использованием набора для анализа щелочной фосфатазы SensoLyte ® p NPP (AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA). После подготовки образца образцы смешивали с раствором субстрата p NPP. Смеси инкубировали в течение 30–60 мин и добавляли стоп-раствор. Количество ALP количественно определяли с помощью ELISA при 405 нМ.

    Результаты и обсуждение

    Морфология и характеристика hBM-MSCs

    HBM-MSC культивировали в остеогенной дифференцирующей среде и обрабатывали MP или подвергали воздействию EMF в течение 7 дней. Морфология hBM-MSCs во время остеогенеза в различных экспериментальных условиях [контроль (без обработки), включение MP, воздействие EMF, включение MP и воздействие EMF] показано в Рис. 2 , Никаких морфологических изменений или некроза hBM-MSCs не наблюдалось после индукции остеогенной дифференцировки ( Рис. 2 ). Следовательно, включение MP, воздействие EMF и включение MP в сочетании с воздействием EMF не вызывали каких-либо цитотоксических эффектов.

    Иммуногистохимическое окрашивание

    Для оценки уровней экспрессии белка в остеогенных маркерах и минерализации было проведено иммуногистохимическое окрашивание. Белок остеокальцина специфически синтезируется остеобластами и является маркером дифференцировки остеобластов на поздних стадиях формирования кости ( 11 ). Остеонектин - это гликопротеин в костях, который связывает натрий. Он выделяется остеобластами во время формирования кости, инициируя минерализацию и способствуя образованию минеральных кристаллов ( 12 ). Остеопонтин является высокофосфорилированным сиалопротеином, который является важным компонентом минерализованных внеклеточных матриц костей ( 13 ). Остеогенные маркеры (остеокальцин, остеопонтин и остеонектин) были сильно экспрессированы в клетках, обработанных МП, в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП, по сравнению с контрольной группой ( Рис. 3A – L ). Результаты иммуногистохимического окрашивания уровней экспрессии остеогенных маркеров представлены в Таблица II ,

    Результаты иммуногистохимического окрашивания уровней экспрессии остеогенных маркеров представлены в   Таблица II   ,

    Таблица II

    Результаты окрашивания остеогенных маркеров.

    Таблица II

    Результаты окрашивания остеогенных маркеров.

    Контрольный MP EMF MP + EMF Остеокальцин - + ++ ++ Остеонектин + ++ +++ +++ Остеопонтин + +++ ++ +++ фон Косса - ++ + ++

    окрашивание фон Косса широко используется для количественной оценки минерализации ( 14 - 16 ). Обычно считается, что в методике фон Косса катионы серебра реагируют с фосфатами и карбонатами в отложениях кальция ( 17 ). Мы использовали окрашивание фон Косса для изучения минерализации hBM-MSCs во время остеогенеза ( Рис. 3M – P ). Необработанные hBM-MSC (контроль) или те, которые подвергались воздействию EMF, растущим в остеогенной среде, обнаруживали небольшое количество минерализации матрикса; однако, hBM-MSC, обработанные MP и обработанные MP и подвергшиеся воздействию EMF, показали более сильную минерализацию матрицы по сравнению с необработанными контролями на 7-й день. Количество минерализации в каждой группе обработки показано на Таблица II ,

    РТ-КПЦР

    Уровни экспрессии мРНК генов, связанных с остеогенезом, из hBM-MSCs после индукции остеогенной дифференцировки в течение 3 дней показаны на Рис. 4А , Маркеры остеобластов, остеокальцин, остеопонтин и остеонектин были высоко экспрессированы в hBM-MSC, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП. Мы также исследовали уровни экспрессии основных генов белка костного матрикса, таких как коллаген I, коллаген III, BMP-2 и BSP. BMP-2 индуцирует дифференцировку остеобластов, воздействуя непосредственно на MSC, и клинически используется для индукции формирования кости, хотя требуются большие дозы ( 18 ). BSP представляет собой сильно посттрансляционно модифицированный кислый фосфорный белок, обычно экспрессируемый в минерализованной ткани, такой как кость и дентин ( 19 ). Репрезентативные гены, связанные с остеогенезом, были в высокой степени экспрессированы в hBM-MSC, обработанных MP, тех, которые подвергались воздействию EMF, и тех, которые получали MP и подвергались воздействию EMF. Результаты наших экспериментов показали, что уровни экспрессии BSP, OPN, OCN и коллагена I были значительно увеличены в группе EMF с воздействием MP. Экспрессия остеогенного гена может использоваться в качестве раннего показателя во время остеогенеза. BSP является маркером поздней стадии дифференцировки остеобластов и маркером ранней стадии минерализации матрикса. OPN экспрессируется в течение всего периода созревания матрицы, затем следует BSP и, наконец, OCN, что характеризует фазу после размножения. Белок OCN специфически синтезируется остеобластами и является маркером дифференцировки остеобластов на более поздних стадиях формирования кости. Коллаген I является наиболее распространенным белком в костном матриксе и является ранним маркером остеобластической дифференцировки и основным органическим компонентом минерализованного костного матрикса. Кроме того, экспрессию мРНК фактора транскрипции Runx-2 измеряли с помощью RT-КПЦР. Runx-2 участвует в производстве белков костного матрикса, так как он способен усиливать экспрессию генов основных белков костного матрикса, приводя к увеличению количества незрелых остеобластов из плюрипотентных стволовых клеток; незрелые остеобласты образуют незрелую кость ( 20 - 25 ). Runx-2 был сильно выражен в hBM-MSC, обработанных MP, тех, кто подвергался воздействию EMF, и тех, кто подвергался воздействию MP и подвергался воздействию EMF по сравнению с необработанным контролем.

    Недавние исследования показали, что активация кальция влияет на формирование кости. Клар и др. ( 26 ) сообщили, что спонтанная индукция образования кости инициируется локальным пиком дифференцировки активирующих кальций стволовых клеток и индукцией образования кости. Более того, Вен и др. ( 27 ) упомянул, что ингибирование напряжения-зависимого кальциевого канала L-типа (VDCCL) подавляет пролиферацию и остеогенную дифференцировку MSCs крысы (rMSC), но способствует апоптозу. Эти результаты позволяют предположить, что VDCCL играет решающую роль в пролиферации и остеогенной дифференцировке rMSC. Основываясь на этих знаниях, мы исследовали влияние воздействия MP и EMF на экспрессию генов, связанных с кальциевыми каналами, в МСК hBM во время остеогенеза. После 3 дней остеогенеза и лечения с использованием MP и EMF уровни экспрессии мРНК CACNA1C и CACNA1I в клетках, обработанных MP, в клетках, подвергшихся воздействию EMF, и в клетках, обработанных MP и воздействующими EMF, были несколько выше по сравнению с контрольной группой. ( Рис. 4B ). Кроме того, уровни экспрессии CACNA1E и CACNA1G были значительно выше в клетках, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП ( Рис. 4B ). Это говорит о том, что кальциевый канал hBM-MSC активировался во время остеогенной дифференцировки.

    Вестерн-блот анализ

    Для изучения остеогенной дифференцировки связанные с остеогенезом белки были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга на 7-й день индукции. Как показано в Рис. 5 уровни экспрессии белков, связанных с остеогенезом (BSP, BMP-2, остеопонтин и остеонектин), были повышены в клетках, обработанных МП, в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и в которых воздействовали ЭМП, по сравнению с контрольной группой.

    Чтобы исследовать потенциальную активацию p-ERK во время остеогенеза, проводили вестерн-блот анализ. В нескольких исследованиях сообщалось, что активация p-ERK является важным медиатором индуцированной фактором роста пролиферации и дифференцировки клеток в клетках различных типов, включая остеобласты ( 28 - 31 ). Капур и др. ( 32 ) продемонстрировали, что активация ERK1 / 2 механическими стимулами участвует в синтезе коллагена и выработке остеопонтина. В настоящем исследовании, после 7 дней остеогенеза с включением MP и воздействием EMF, экспрессия p-ERK была увеличена, и она была высоко экспрессирована в клетках, обработанных MP и подвергающихся воздействию EMF ( Рис. 5 ).

    Анализ FACS

    Некоторые антигены известны как поверхностные маркеры MSC. Сообщалось, что антитела против CD73 (мембраносвязанной экто-5'-нуклеотисидазы), CD90 (Thy-1), CD105 (эндоглин) реагируют с недифференцированными MSC ( 33 - 35 ).

    Чтобы выяснить, влияет ли включение MP и воздействие ЭМП на дифференциацию hBM-MSC, был проведен анализ FACS для маркеров hBM-MSC, CD73, CD90 и CD105 ( Рис. 6 ). Уровень экспрессии CD73 составил 91% в контрольной группе, 76% в группе включения МР, 88% в группе, подверженной воздействию ЭМП, и 77% в группе включения МП при воздействии группы ЭМП через 7 дней. Уровень экспрессии CD90 составлял 100% в контрольной группе, 94% в группе включения МР, 96% в группе, подверженной воздействию ЭМП, и 77% в группе включения МР при воздействии группы ЭМП. Экспрессия CD105 составила 95% в контрольной группе, 80% в группе включения МР, 92% в группе, подвергшейся воздействию ЭМП, и 77% в группе включения МП при воздействии группы ЭМП. Уровни экспрессии поверхностных антигенов hBM-MSC были снижены в клетках, обработанных МП, в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и в условиях воздействия ЭМП, по сравнению с контрольной группой. В заключение, наши данные указывают на то, что включение MP и воздействие EMF изменяют экспрессию поверхностного антигена MSC, предполагая, что hBM-MSCs дифференцируются в специфический тип клеток, таким образом изменяя их клеточную судьбу.

    Анализ клеточной пролиферации и активности

    Было определено, что количество клеток составляет примерно 3,4 × 10 5 клеток в контрольной группе, 3,7 × 10 5 клеток в группе включения МР, 3,1 × 10 5 клеток в группе, подвергшейся воздействию ЭМП, и 3,9 × 10 5 клеток в включении МП с воздействием группы ЭМП через 7 дней ( Рис. 7А ).

    Как показывают результаты подсчета клеток, клетки, обработанные MP и клетки, обработанные MP и подвергшиеся воздействию EMF, демонстрировали слегка ускоренный рост клеток по сравнению с контрольной группой, в то время как группа, подвергавшаяся воздействию EMF, показала более замедленный рост клеток по сравнению с контрольной группой. ( Рис. 7А ).

    Кроме того, жизнеспособность клеток и токсичность для hBM-MSC были измерены с помощью МТТ-анализа через 7 дней после остеогенеза. МТТ-анализ дает ценную информацию о потенциальной жизнеспособности клеток и цитотоксических эффектах. Хотя количество клеток уменьшилось после воздействия ЭМП и увеличилось после лечения МП и лечения МП в сочетании с воздействием ЭМП, митохондриальная активность клеток в 4 экспериментальных группах была сходной ( Рис. 7B ). Более того, эти результаты продемонстрировали, что цитотоксические эффекты не были обнаружены в hBM-MSC, обработанных МП, и в тех, которые подвергались воздействию EMF во время остеогенеза.

    Активность ЛДГ и АЛП

    ЛДГ является цитоплазматическим каталитическим ферментом, связанным с обратимым превращением пировиноградной и молочной кислот. ЛДГ выделяется через клеточную мембрану, когда она повреждена ( 36 ). Следовательно, меньшее выделение ЛДГ означает меньшее клеточное повреждение. Таким образом, среда была собрана и проанализирована через 7 дней с целью изучения повреждения клеток.

    В клетках, обработанных МП, и в клетках, обработанных МП и подвергшихся воздействию ЭМП, наблюдалось снижение секреции ЛДГ ( Рис. 8А ). Активность ЛДГ в 4 экспериментальных группах была сходной, что свидетельствует о том, что лечение МП и воздействие ЭМП не влияли на секрецию ЛДГ и не вызывали повреждения клеточной мембраны.

    ALP является ранним связанным с минерализацией белковым маркером для остеогенеза остеобластов ( 37 ). Эффекты включения MP и воздействия EMFs на клеточную активность ALP во время остеогенеза были изучены путем измерения продуктов реакции ALP в необработанных клетках (контроль), в клетках, обработанных MP, теми, которые подвергались воздействию EMF, и в тех, которые обрабатывались MP и подвергались воздействию ЭДС с течением времени. Несколько ALP-позитивных клеток наблюдали в клетках, подвергшихся воздействию ЭМП, и в клетках, обработанных МП и подвергающихся воздействию ЭМП ( Рис. 8B ). Эти результаты предполагают, что включение MP в сочетании с воздействием EMFs увеличивает активность ALP в hBM-MSCs во время остеогенеза.

    В заключение, в настоящем исследовании были изучены эффекты лечения МП в сочетании с воздействием ЭМП на дифференцировку клеток. Мы обрабатывали hBM-MSC с помощью 50 мкг / мл Fe 3 O 4 MP или подвергали их воздействию частоты 45 Гц и интенсивности 1 мТл ЭДС два раза в 8 часов в день в течение 7 дней. Во время остеогенеза морфологические изменения и цитотоксические эффекты не наблюдались. Экспрессию остеогенных маркеров определяли иммуногистохимическим окрашиванием, RT-КПЦР и вестерн-блоттингом, демонстрируя увеличение экспрессии. Анализ FACS показал, что обработка MP и воздействие ЭМП снижали экспрессию поверхностных маркеров MSC; это говорит о возможности дифференциации hBM-MSC. Минерализация hBM-MSCs в группе включения МР или в группе, подверженной воздействию ЭМП, наблюдалась с помощью анализа ALP. Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что лечение hBM-MSCs с помощью MP или их воздействия на EMF увеличивает остеогенную дифференцировку, и что включение MP в сочетании с воздействием EMF является более эффективным в усилении остеогенной дифференцировки. Результаты нашего исследования демонстрируют, что МП могут быть потенциально использованы для медицинских инструментов или материалов строительных лесов, и что ЭМП могут быть использованы для реабилитации остеогенных ран.

    Подтверждения

    Настоящее исследование было поддержано программой Исследовательского центра Pioneer через Национальный исследовательский фонд Кореи, финансируемый Министерством науки, ИКТ и планирования будущего, Республика Корея (грант № 2009-0082941).

    Рекомендации

    1

    Садан О., Меламед Э. и Оффен Д. Терапия мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга при нейродегенеративных заболеваниях. Эксперт Опин Биол Тер. 9: 1487-1497. 2009. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    2

    Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, Рейес M, Ленвик T, Лунд T, Блэкстад M, Du J, Олдрич С., Лисберг А, Low WC, Largaespada DA и Verfaillie C: Плюрипотентность мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга взрослого человека. Природа. 418: 41-49. 2002. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    3

    Bielby R, Jones E и McGonagle D: роль мезенхимальных стволовых клеток в поддержании и восстановлении кости. Травма. 38 (Приложение 1): S26 – S32. 2007. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    4

    Фукада Е и Ясуда I: о пьезоэлектрическом эффекте кости. J Phys Soc Japan. 12: 1158-1162. 1957. Посмотреть статью : Google ученый

    5

    Бассетт CA и Pawluk RJ: Влияние электрических токов на кости in vivo. Природа. 204: 652-654. 1964. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    6

    Tsai MT, Li WJ, Tuan RS и Chang WH: модуляция остеогенеза в мезенхимальных стволовых клетках человека с помощью стимуляции специфическим импульсным электромагнитным полем. J Orthop Res. 27: 1169-1174. 2009. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    7

    Sun LY, Hsieh DK, Lin PC, Chiu HT и Chiou TW: Импульсные электромагнитные поля ускоряют пролиферацию и экспрессию остеогенных генов в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга человека во время остеогенной дифференцировки. Bioelectromagnetics. 31: 209-219. 2010.

    8

    Pankhurst QA, Connolly J, Jones S и Dobson J: Применение магнитных наночастиц в биомедицине. J Phys D Appl Phys. 36: R167-R181. 2003. Посмотреть статью : Google ученый

    9

    Картмелл С.Х., Добсон Дж., Вершурен С.Б. и Эль-Хадж А.Дж .: Разработка методов магнитных частиц для длительной культуры костных клеток с прерывистой механической активацией. IEEE Trans Nanobioscience. 1: 92-97. 2002. Посмотреть статью : Google ученый

    10

    Чо Х, Чой Ю.К., Ли Д.Х., Парк Х.Дж., Сео Й.К., Юнг Х., Ким С.К., Ким С.М. и Пак Дж.К .: Влияние магнитных стволовых клеток человеческого мозга, полученных из наночастиц, под воздействием импульсных электромагнитных полей на позвоночник поврежденной крысы шнур. Биотехнология Аппл Биохем. 60: 596-602. 2013. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    11

    Ducy P, Десбуа C, Бойс B, Пинеро G, Стори B, Dunstan C, Смит E, Бонадио J, Гольдштейн S, Гундберг C, Брэдли A и Карсенти G: Повышенное образование кости у мышей с дефицитом остеокальцина. Природа. 382: 448-452. 1996. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    12

    Kelm RJ Jr, Hair GA, Mann KG и Grant BW: характеристика остеобластов человека и остеонектина, полученного из мегакариоцитов (SPARC). Кровь. 80: 3112-3119. 1992. PubMed / NCBI

    13

    Содек Дж, Гансс Б и Макки М: Остеопонтин. Crit Rev Oral Biol Med. 11: 279-303. 2000. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    14

    von Kossa J: Uber die im Organismus künstlich erzeugbaren Verkalkungen. Бейт Путь Анат. 29: 163-202. 1901 г. (на немецком языке).

    15

    Законопроекты C, Eisenberg H и Pallante SL: Комплексы органических кислот с фосфатом кальция: пятно фон Косса как ключ к составу костного минерала. Johns Hopkins Med J. 128: 194–207. 1971. PubMed / NCBI

    16

    Пухтлер Х. и Мелоан С. О химии фиксации формальдегида и ее влиянии на иммуногистохимические реакции. Гистохимия. 82: 201-204. 1985. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    17

    Мелан С. Н. и Пухтлер Х. Химические механизмы методов окрашивания: метод фон Коссы: что на самом деле написал фон Косса, и модифицированная реакция для селективной демонстрации неорганических фосфатов. J Histotechnol. 8: 11-13. 1985. Посмотреть статью : Google ученый

    18

    Schwartz Z, Саймон B, Duran M, Barabino G, Chaudhri R и Boyan B: Импульсные электромагнитные поля усиливают BMP-2-зависимую остеобластическую дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток человека. J Orthop Res. 26: 1250-1255. 2008. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    19

    Шварц З., Ломанн С., Офингер Дж., Боневальд Л., Дин Д. и Боян Б. Характеристики поверхности имплантата модулируют дифференцировочное поведение клеток в линии остеобластов. Adv Dent Res. 13: 38-48. 1999. Посмотреть статью : Google ученый

    20

    Огава Е., Инузука М., Маруяма М., Сатаке М., Найто-Фуджимото М., Ито Y и Шигесада К. Молекулярное клонирование и характеристика PEBP2β, гетеродимерного партнера нового ДНК-связывающего белка Drosophila runt, связывающего ДНК PEBP2α. Вирусологии. 194: 314-331. 1993. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    21

    Миёси Х, Шимицу К, Козу Т, Масеки Н., Канеко Y и Оки М: t (8; 21) точки останова на хромосоме 21 при остром миелобластном лейкозе сгруппированы в ограниченной области одного гена, AML1. Proc Natl Acad Sci USA. 88: 10431-10434. 1991. Посмотреть статью : Google ученый

    22

    Комори Т, Яги Х, Номура С, Ямагути А, Сасаки К, Дегучи К, Симидзу Y, Бронсон Р, Гао ЙХ, Инада М, Сато М, Окамото Р, Китамура Й, Йошики С и Кишимото Т: Целевое нарушение результатов Cbfa1 при полном отсутствии костеобразования вследствие остановки созревания остеобластов. Cell. 89: 755-764. 1997. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    23

    Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL и Karsenty G: Osf2 / Cbfa1: транскрипционный активатор дифференцировки остеобластов. Cell. 89: 747-754. 1997. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    24

    Отто Ф., Торнелл А.П., Кромптон Т., Дензел А., Гилмор К.С., Розуэлл И.Р., Стамп Г.В., Беддингтон Р.С., Мундлос С., Олсен Б.Р., Селби П.Б. и Оуэн М.Дж .: Cbfa1, кандидатный ген для синдрома клеидокраниальной дисплазии, необходим для остеобласта дифференциация и развитие костей. Cell. 89: 765-771. 1997. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    25

    Комори Т: Регуляция развития генов белка и генов внеклеточного матрикса с помощью RUNX2. Cell Tissue Res. 339: 189-195. 2010. Посмотреть статью : Google ученый

    26

    Klar RM, Duarte R, Dix-Peek T, Dickens C, Ferretti C и Ripamonti U: Ионы кальция и остеокластогенез инициируют образование костной ткани с помощью полученных из кораллов макропористых конструкций. J Cell Mol Med. 17: 1444-1457. 2013. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    27

    Wen L, Wang Y, Wang H, Kong L, Zhang L, Chen X и Ding Y: Кальциевые каналы L-типа играют решающую роль в пролиферации и остеогенной дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Biochem Biophys Res Commun. 424: 439-445. 2012. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    28

    Lai CF, Chaudhary L, Fausto A, Halstead LR, Ory DS, Avioli LV и Cheng SL: Erk необходим для роста, дифференцировки, экспрессии интегрина и клеточных функций в клетках остеобластов человека. J Biol Chem. 276: 14443-14450. 2001. PubMed / NCBI

    29

    Азума Н., Дузгун С.А., Икеда М., Кито Н., Акасака Н., Сасаджима Т. и Сумпио Б.Е .: Ответ эндотелиальных клеток на различные механические силы. J Vasc Surg. 32: 789-794. 2000. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    30

    Олденхоф А.Д., Шинлова О.П., Лю М., Лангилл Б.Л. и Лай С.Дж. Активированные митогеном протеинкиназы опосредуют вызванную растяжением экспрессию мРНК c-fos в клетках гладких мышц миометрия. Am J Physiol Cell Physiol. 283: C1530-C1539. 2002. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    31

    Ferraro JT, Daneshmand M, Bizios R и Rizzo V: истощение холестерина в плазматической мембране снижает гидростатическое давление и вызванные сдвиговым стрессом пути механотрансдукции в культурах остеобластов. Am J Physiol Cell Physiol. 286: C831-C839. 2004. Посмотреть статью : Google ученый

    32

    Kapur S, Baylink DJ и Lau KH: напряжение сдвига в потоке жидкости стимулирует пролиферацию и дифференцировку остеобластов человека посредством множества взаимодействующих и конкурирующих путей передачи сигнала. Кость. 32: 241-251. 2003. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    33

    Schieker M, Pautke C, Haasters F, Schieker J, Docheva D, Böcker W, Guelkan H, Neth P, Jochum M и Mutschler W: мезенхимальные стволовые клетки человека на одноклеточном уровне: одновременная иммунофлюоресценция из семи цветов. J Анат. 210: 592-599. 2007. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    34

    Барри Ф.П. и Мерфи Дж. Мезенхимальные стволовые клетки: клиническое применение и биологическая характеристика. Int J Biochem Cell Biol. 36: 568-584. 2004. Посмотреть статью : Google ученый : PubMed / NCBI

    35

    Бобис С, Яроха Д и Майка М: Мезенхимальные стволовые клетки: характеристика и клиническое применение. Фоли Гистохим Цитобиол. 44: 215-214. 2007. PubMed / NCBI

    36

    Mitchell DB, Santone KS и Acosta D. Оценка цитотоксичности в культивируемых клетках по утечке фермента. J Методы культа ткани. 6: 113-116. 1980. Посмотреть статью : Google ученый

    37

    Gundberg C, Looker A, Nieman S и Calvo M: паттерны остеокальцина и костной щелочной фосфатазы в зависимости от возраста, пола, расы или этнической принадлежности. Кость. 31: 703-708. 2002. Посмотреть статью : Google ученый